相差顯微鏡的介紹及說明

相差顯微鏡介紹：

相差顯微鏡又稱相襯顯微鏡是荷蘭科學(xué)家Zernike于1935年發(fā)明的，用于觀察未染色標(biāo)本的顯微鏡。活細(xì)胞和未染色的生物標(biāo)本，因細(xì)胞各部細(xì)微結(jié)構(gòu)的折射率和厚度的不同，光波通過時(shí)，波長和振幅并不發(fā)生變化，僅相位發(fā)生變化（振幅差），這種振幅差人眼無法觀察。而相差顯微鏡通過改變這種相位差，并利用光的衍射和干涉現(xiàn)象，把相差變?yōu)檎穹顏碛^察活細(xì)胞和未染色的標(biāo)本。相差顯微鏡和普通顯微鏡的區(qū)別是：用環(huán)狀光闌代替可變光闌， 用帶相板的物鏡代替普通物鏡，并帶有一個(gè)合軸用的望遠(yuǎn)鏡。

理論基礎(chǔ)

相差是指同一光線經(jīng)過折射率不同的介質(zhì)其相位發(fā)生變化并產(chǎn)生的差異。相位指在某一時(shí)間上，光的波動(dòng)所達(dá)到的位置。一般由于被檢物體（如不染色的細(xì)胞）所能產(chǎn)生的相差太小，肉眼很難分辨，只有在變相差為振幅差（明暗差）之后才能被區(qū)分。相差決定于光波所通過介質(zhì)的折射率之差及其厚度，等于折射率與厚度的乘積之差（即光程之差）。而相差顯微鏡就是利用被檢物的光程之差進(jìn)行鏡檢的。

細(xì)胞生物學(xué)的研究儀器中 相差顯微鏡，透射電子顯微鏡和掃描隧道電子顯微鏡的設(shè)計(jì)或發(fā)明獲得了諾貝爾獎(jiǎng)。

差別

相差顯微鏡有四個(gè)特殊結(jié)構(gòu)：相差物鏡、具有環(huán)狀光闌的轉(zhuǎn)盤聚光器、合軸調(diào)中望遠(yuǎn)鏡和綠色的濾光片。綠色濾光片作用是：縮小照明光線波長范圍，減少由于照明光線的波長不同引起的相位變化。

用途

觀察未經(jīng)染色的標(biāo)本和活細(xì)胞。

基本原理

利用物體不同結(jié)構(gòu)成分之間的折射率和厚度的差別，把通過物體不同部分的光程差轉(zhuǎn)變?yōu)檎穹ü鈴?qiáng)度）的差別，經(jīng)過帶有環(huán)狀光闌的聚光鏡和帶有相位片的相差物鏡實(shí)現(xiàn)觀測(cè)的顯微鏡。主要用于觀察活細(xì)胞或不染色的組織切片，有時(shí)也可用于觀察缺少反差的染色樣品。

把透過標(biāo)本的可見光的光程差變成振幅差，從而提高了各種結(jié)構(gòu)間的對(duì)比度，使各種結(jié)構(gòu)變得清晰可見。光線透過標(biāo)本后發(fā)生折射，偏離了原來的光路，同時(shí)被延遲了1/4λ（波長），如果再增加或減少1/4λ，則光程差變?yōu)?/2λ，兩束光合軸后干涉加強(qiáng)，振幅增大或減下，提高反差。在構(gòu)造上，相差顯微鏡有不同于普通光學(xué)顯微鏡4個(gè)特殊之處：

1.環(huán)形光闌（annular diaphragm） 位于光源與聚光器之間，作用是使透過聚光器的光線形成空心光錐，焦聚到標(biāo)本上。

2.相位板（annular phaseplate）在物鏡中加了涂有氟化鎂的相位板，可將直射光或衍射光的相位推遲1/4λ。分為兩種：

（1）A+相板：將直射光推遲1/4λ，兩組光波合軸后光波相加，振幅加大，標(biāo)本結(jié)構(gòu)比周圍介質(zhì)更加變亮，形成亮反差（或稱負(fù)反差）。

（2）B+相板：將衍射光推遲1/4λ，兩組光線合軸后光波相減，振幅變小，形成暗反差（或稱正反差），結(jié)構(gòu)比周圍介質(zhì)更加變暗。

3.合軸調(diào)節(jié)望遠(yuǎn)鏡：用于調(diào)節(jié)環(huán)狀光闌的像與相板共軛面*吻合。

修理維護(hù)

相差顯微鏡使用中的幾個(gè)問題：

（1）相位倒轉(zhuǎn) 當(dāng)n’<n或n’>n時(shí)得到象的明暗反差正好相反，稱為相位倒轉(zhuǎn)。當(dāng)相位差δ=0時(shí)是無法識(shí)別的，隨著δ的增大反差變大，當(dāng)δ繼續(xù)增大到某一值后會(huì)出現(xiàn)相位倒轉(zhuǎn)。用90%高吸光值（高反差）物鏡時(shí)，這個(gè)轉(zhuǎn)變值約為0.55λ，用70%標(biāo)準(zhǔn)吸光值的物鏡時(shí)約為0.33λ。較高吸光值的物鏡應(yīng)該用于分辨較小的光程差。

（2）暈輪和漸暗效應(yīng) 在相差顯微鏡成象過程中，某一結(jié)構(gòu)由于相位的延遲而變暗時(shí)，并不是光的損失，而是光在象平面上重新分配的結(jié)果。因此在黑暗區(qū)域明顯消失的光會(huì)在較暗物體的周圍出現(xiàn)一個(gè)明亮的暈輪。這是相差顯微鏡的缺點(diǎn)，它妨礙了精細(xì)結(jié)構(gòu)的觀察，當(dāng)環(huán)狀光闌很窄時(shí)暈輪現(xiàn)象更為嚴(yán)重。相差顯微鏡的另一個(gè)現(xiàn)象是漸暗效應(yīng)，指相差觀察相位延遲相同的較大區(qū)域時(shí)，該區(qū)域邊緣會(huì)出現(xiàn)反差下降。

（3）樣品厚度的影響 當(dāng)進(jìn)行相差觀察時(shí)，樣品的厚度應(yīng)該為5μm或者更薄，當(dāng)采用較厚的樣品時(shí)，樣品的上層是很清楚的，深層則會(huì)模糊不清并且會(huì)產(chǎn)生相位移干擾及光的散射干擾。

（4）蓋玻片和載玻片的影響樣品一定要蓋上蓋上蓋玻片，否則環(huán)狀光闌的亮環(huán)和相板的暗環(huán)很難重合。相差觀察對(duì)載玻片和蓋玻片的玻璃質(zhì)量也有較高的要求，當(dāng)有劃痕，厚薄不均或凹凸不平時(shí)會(huì)產(chǎn)生亮環(huán)歪斜及相位干擾。另外玻片過厚或過薄時(shí)會(huì)使環(huán)狀光闌亮環(huán)變大或變小。